Los espermatozoides congelados-descongelados de diferentes especies de mamíferos experimentan con éxito la capacitación in vitro en condiciones específicas y definidas, sin embargo, la inducción de la capacitación in vitro de espermatozoides equinos aún requiere optimizaciones. El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de diferentes medios de cultivo en la inducción de la capacitación in vitro de espermatozoides de semental descongelados. Para ello, los espermatozoides se descongelaron e incubaron con diferentes combinaciones de inductores capacitantes durante 2 h. En nuestro estudio se utilizaron cinco medios diferentes: medio sin capacitación (NC), medio basal que incluía BSA y bicarbonato, medio basal más el inductor capacitante dibutiril AMP cíclico (dbAMPc) como activador de PKA, un inhibidor de la fosfodiesterasa, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y un aceptor de colesterol, metil-b-ciclodextrina (MβCD). Se evaluaron la fluidez de la membrana, la reacción acrosómica y los niveles de calcio intracelular después de 2 h de incubación, pero no encontramos diferencias entre los grupos. También se observó un comportamiento diferente entre los sementales. Finalmente, los tratamientos de los espermatozoides se evaluaron utilizando un ensayo de unión de homólogos a la zona pelúcida. Este ensayo mostró que la incubación en medio basal que incluía MβCD aumentó el número de espermatozoides adheridos a la zona pelúcida de los ovocitos de yegua. Se necesitan más estudios para evaluar el efecto de estas condiciones en la fertilización in vitro de especies equinas utilizando espermatozoides descongelados.